Projektbereich A

Methodische Entwicklungen

Die fünf Teilprojekte des Projektbereichs A haben sich das gemeinsame Ziel gesetzt, High-End-Lichtmikroskopieverfahren, die entwickelt wurden, um mehr über die Funktion von Membranrezeptoren zu erfahren und die Verfahren selbst zu optimieren. Die in diesen Teilprojekten angewendeten Methoden erscheinen zunächst auf den ersten Blick heterogen, doch gerade diese Heterogenität lässt erwarten, dass der Sonderforschungsbereich einen besonderen Impuls für die Gewinnung neuer und vielfältiger Informationen über die Rezeptorfunktion schafft.

A1

Aufbau freitragender Lipiddoppelschichten mit Diffusionsunterdrückung für die konfokale Einzelmolekül-FLIM-FRET Analyse von schaltbaren Membranrezeptoren und Transportern

Der G-Protein gekoppelte Membranrezeptor Neurotensin-1 (NTSR-1) wird in Bakterien exprimiert, aufgereinigt und mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen für Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfer (smFRET) Messungen markiert. Rekonstitutierte NTSR-1 oder HCN2-Ionenkanäle werden mit einer planaren Lipidmembrane (BLM) fusioniert. Dynamische Konformationsänderungen werden in Mikrofluidik-Strukturen mit einstellbaren Potentialen konfokal-zeitaufgelöst oder mittels Weitfeld-smFRET-Mikroskopie untersucht. Diffusion von Membranproteinen in der BLM wird durch ein Annexin-V Netzwerk unterdrückt.

A2

Markerfreie Untersuchung von Struktur-Funktions-Relationen einzelner Membranrezeptoren durch spitzenverstärkte Raman-Streuung

Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung und Anpassung einer markerfreien und strukturspezifischen Untersuchung von Membranrezeptoren bzw. Membranrezeptor-Oberflächen, mit Nanometer-Ortsauflösung. Die Anwendung von Spitzenverstärkter-Raman-Spektroskopie (TERS = tip-enhanced Raman spectroscopy) auf die Anforderungen von biologischen Membranen, erlaubt die Identifizierung einzelner Membranrezeptoren. Dies dient zur Aufklärung von Struktur-Funktions-Beziehungen sobald gezielt extern Veränderungen am Rezeptor ausgelöst werden. Auf diese Weise sollen im Rahmen des Projekts Transportvorgänge an einzelnen Proteinen unter kontrollierten Bedingungen untersucht werden.

A3

Verbesserte optogenetische Werkzeuge: Charakterisierung von neuartigen Rhodopsinen und Konstruktion von neuen Eigenschaften in bekannte Photorezeptoren

Im Teilprojekt A3 planen wir, verbesserte optogenetische Werkzeuge zu entwickeln, die sich durch höheren Licht-induzierten Strom und höhere Licht-Sensitivität auszeichnen. Dafür wollen wir bekannte Photorezeptoren zielgerichtet mutieren und neuartige Photorezeptoren besser charakterisieren. Insbesondere haben wir vor, neue Channelrhodopsin-Mutanten zu testen, sowie Fusionen aus Nukleotid-Zyklasen und CNG-Kanälen zu generieren und zu charakterisieren.

A4

Mehrdimensionale hochauflösende Bildgebung von Membranrezeptoren

Zur Visualisierung und Quantifizierung der räumlichen Verteilung von mehr als zehn verschiedenen Zielmolekülen in einem einzigen Experiment, soll eine neue Methode entwickelt werden, die sich durch mehrfach wiederholende Schritte der Markierung und des Super-Resolution Imaging mit dem gleichen Farbstoff auszeichnet. Zur effizienten Entfernung des Farbstoffes vor der nächsten Markierungs- und Imagingrunde, werden verschiedene Ansätze, wie Photozerstörung, Photoabspaltung des Farbstofflinkers, und transiente Bindung von kurzen farbstoffmarkierten Oligonukleotiden entwickelt und optimiert.

A5

Zusammenhang zwischen Bindung einzelner Liganden und Aktivierung einzelner HCN- und CNG-Kanäle

Von CNGA2-Kanälen sollen die Bindung einzelner markierter cGMP-Moleküle und die Einzelkanal-Aktivität simultan gemessen werden. Zusätzlich soll eine Analyse für aufgeklebte Membranen entwickelt werden, um die Verweildauer einzelner markierter cAMP-Moleküle an den vier Untereinheiten eines HCN2-Kanals zu analysieren. Neue cGMP- und cAMP-Derivate sollen synthetisiert werden. Die Resultate sollen zu einem besseren Verständnis der Interaktion der vier Untereinheiten in den Kanälen führen und den Effekt der Spannung auf diese Interaktion in HCN2-Kanälen erklären.

Projektbereich B

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle

Im Projektbereich B sind acht Teilprojekte zusammengefasst, die die High-End-Lichtmikroskopie verwenden, um die Funktion von Liganden-gesteuerten Ionenkanälen, d.h. ionotropen Rezeptoren, aufzuklären. Fünf dieser Projekte (B2, B3, B4, B5, B6) konzentrieren sich auf die Untersuchung von Kanälen der Synapse, eine biologischen Struktur, deren Abmessung zu klein für eine Analyse mit herkömmlicher Lichtmikroskopie ist. Aufgrund dieses Sachverhalts wird die hochauflösende Mikroskopie als leistungsstarkes Werkzeug genutzt, um morphologische Eigenschaften in Synapsen zu analysieren. Obwohl die Auflösung der der Elektronenmikroskopie unterlegen ist, bietet die hochauflösende Lichtmikroskopie Vorteile, so ist die Markierung von Proteinen wesentlich einfacher. Ebenfalls bietet sie die Möglichkeit mit unterschiedlichen Fluorophoren, die Licht bei verschiedenen Wellenlängen emittieren, Proteine zu markieren. Darüber hinaus birgt die hochauflösende Lichtmikroskopie das Potential, Daten in Vitalpräparaten zu generieren, auch wenn dieser Aspekt aufgrund der Wärmebewegung der Strukturen die Analyse anspruchsvoll macht. Im Einzelnen sind werden NMDA-, GABA-A- und Glutamat-Rezeptoren der neuromuskulären Synapse sowie präsynaptischen Glutamat-Rezeptoren des Kainat-Subtyps und Glycin-Rezeptoren des Rückenmarks untersucht.

B1

Untersuchung der Assemblierung, der Ligandenbindung und des Schaltens heterotetramerer CNG-Kanäle über FRET-Messungen

Durch cyclische Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNG-Kanäle) stellen den letzten Schritt in der Signaltransduktionskaskade von Photorezeptoren dar. In diesem Projekt sollen mit Hilfe optischer und elektrophysiologischer Techniken die elementaren Schritte, wie die Bindung der Liganden an die jeweiligen Untereinheiten oder die nachfolgenden Konformationsänderungen untersucht werden. Ein zweiter Teil des Projektes zielt auf die Untersuchung der Mechanismen ab, die die feste Stöchiometrie der Untereinheiten gewährleisten, aus denen sich die tetrameren Kanäle zusammensetzen.

B2

Untersuchungen zu humoraler Autoimmunität gegen die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors mittels höchstauflösender Fluoreszenzmikroskopie – Effekte auf synaptische Integrität und Funktion

Dieses Projekt untersucht den Pathomechanismus der Autoimmunreaktion, die durch spezifische Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor im zentralen Nervensystem verursacht wird. Mittels Kombination von höchstauflösender Fluoreszenzmikroskopie und elektrophysiologischen Methoden wird der Einfluss der Autoantikörper auf die biophysikalischen Eigenschaften des NMDA-Rezeptors, auf die glutamaterge Transmission sowie auf die Netzwerkaktivität im Tiermodell untersucht. Dieser Ansatz wird Erkenntnisse zum grundsätzlichen molekularen Mechanismus antineuronaler Autoimmunität mit bislang unerreichter räumlicher und zeitlicher Auflösung bringen.

B3

Interaktion zwischen GABAA-Rezeptor-Funktion und Netzwerkaktivität im sich entwickelnden Hippokampus

Während der frühen Entwicklung generiert das unreife Gehirn synchronisierte, oszillatorische Netzwerkaktivitäten, an deren Entstehung ionotrope GABAA-Rezeptoren wesentlich beteiligt sind. Es ist gegenwärtig weitgehend unbekannt, inwiefern diese frühen neuronalen Aktivitätsmuster ihrerseits die funktionelle und morphologische Entwicklung der GABAergen synaptischen Transmission kontrollieren. Wir werden diese Frage mit Hilfe einer Kombination hochauflösender optischer, elektrophysiologischer und optogenetischer Methoden im unreifen Hippokampus der Maus sowohl in vitro als auch in vivo untersuchen.

B4

Hochauflösung aktivitätsvermittelter Dynamik ionotroper Glutamatrezeptorent in vivo

Die aktivitätsabhängige Reorganisation ionotroper Glutamatrezeptoren vermittelt diverse Formen synaptischer Plastizität. Grundlegende Prinzipien der Rezeptordynamik sind jedoch nur unvollständig verstanden. Durch kombinierte Anwendung von Optogenetik, Elektrophysiologie und hochauflösender Lichtmikroskopie in Drosophila melanogaster, untersucht dieses Forschungsprojekt, wie räumliche und zeitliche Aktivitätsmuster die nanoskopische Mobilität synaptischer Glutamatrezeptor-Untereinheiten im intakten Organismus steuern.

B5

Untersuchungen zur Organisation und Dynamik von Rezeptoren der inhibitorischen Neurotransmission mittels hochauflösender Mikroskopie

Die Regulation der Anzahl und Organisation von Glycin-Rezeptoren in Synapsen ist für die Effizienz und Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit im Rückenmark essentiell. Im Projekt werden daher die Dynamik und Organisation von Glycin-Rezeptor-Clustern sowie die spezifische Rolle von Syndapin I im Rezeptortransport und in Rezeptor-Clustering bzw. -Organisation unter Anwendung superauflösender Lichtmikroskopie analysiert. Highend-Mikroskopie soll die Mechanismen enthüllen, die eine korrekte Bildung, Erhaltung und Adaptation von Glycin-Rezeptor-Synapsen in inhibitorischer Neurotransmission ermöglichen.

B6

Funktionelle Plastizität von Glutamatrezeptorkanälen auf hippokampalen Moosfaserboutons

Moosfaserboutons (MFBs) sind durch einzigartige Plastizität gekennzeichnet, die durch Autorezeptoren für präsynaptisch freigesetztes Glutamat (GluKs) kontrolliert wird. Wir konzentrieren uns auf GluKs, Aktive Zonen (AZs) und MFB-Plastizität. AZs koppeln präsynaptischen Ca2+-Einstrom und Vesikelverschmelzung. Änderungen von Größe, molekularer Zusammensetzung, Anzahl und Funktion von AZs könnten zur Plastizität von MFBs beitragen. Wir zielen darauf ab die Proteindynamik auf Niveau einzelner AZs, Funktion der GluKs und Bedeutung beider für MFB-Plastizität und Gedächtnis zu klären.

B7

Beziehung zwischen Ligandenbindung und Aktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren

Ziel dieses Projektes ist es, die Beziehung zwischen Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden neue ACh-Analoga synthetisiert und charakterisiert und in der konfokalen Patch-Clamp-Fluorometrie angewendet. Durch die parallele Beobachtung von ACh-Bindung und Rezeptoraktivierung werden neue Erkenntnisse für das Verständnis des Desensitisierungsmechanismus erwartet, wobei der spezifische Beitrag der beiden strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen, sowie die Rolle des Clustering-Proteins Rapsyn berücksichtigt werden sollen.

B8

Visualisierung dynamischer Interaktionen innerhalb des Arabidopsis Schließzell Hormonrezeptor/Anionenkanal-Komplexes

Project B8 beleuchtet die Schließzell-exprimierten Anionenkanäle SLAC1 und SLAH3, die Schlüsselregulatoren beim Trockenstresshormon (ABA)-stimulierten Stomaschluss repräsentieren. Mit der Hilfe von hochauflösender Mikroskopie sowie FRET-und FLIM-Techniken und elektrophysiologischen Anwendungen zielen wir auf die Entschlüsselung und Quantifizierung des ABA-signaling Komplexes mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ab. Dabei erwarten wir Erkenntnisse bezüglich i) der ABA-Wahrnehmung in Schließzellen, ii) der ABA-abhängigen Aktivierung von SLAC1 und SLAH3, sowie iii) über die Rolle der Heteromerisierung von SLAC/SLAH Untereinheiten.

Projektbereich C

GPCRs und andere Membranrezeptoren

Im Projektbereich C sind sieben Teilprojekte, die sich mit metabotropen Membranrezeptoren beschäftigen, zusammengefasst. Diese Rezeptoren rufen ihre Wirkung nicht durch die Öffnung einer Pore hervor, sondern durch die Übertragung ihrer Konformationsänderung auf andere Proteine oder durch das Auslösen einer Enzymaktivität in dem Rezeptor selbst. Die Teilprojekte C1 bis C6 beinhalten Untersuchungen zur Funktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Bei Tieren bilden GPCRs die größte Familie von Membranrezeptoren überhaupt, wodurch sehr spezifische Sensitivitäten für Hormone und Neurotransmitter bewirkt werden. GPCRs vermitteln ihre Wirkung durch die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen, die wiederum nachgeschaltete Effektoren, einschließlich Enzymen und Ionenkanälen, aktivieren oder inhibieren. Da GPCRs nicht direkt die Ionenleitfähigkeit verändern, ist die Messung des Verlaufs ihrer Aktivierungszeit im Vergleich zu Liganden-gesteuerten Ionenkanälen schwieriger.

C1

Untersuchung der räumlichen Anordnung und Dynamik von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Einzelmolekül- und Superresolution-Mikroskopie

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Rezeptoren für Hormone und Neurotransmitter und repräsentieren wichtige pharmakologische Ziele. Um die Lokalisierung von GPCRs in dynamischen Nanodomänen auf der Zelloberfläche zu untersuchen, verwenden wir in diesem Projekt neue optische Verfahren wie Einzelmolekül- und hochauflösende Mikroskopie (dSTORM). Unsere Experimente erlauben ein tieferes Verständnis grundlegender Mechanismen von GPCR Signalwegen und können zu innovativen Medikamenten für eine Vielzahl von Krankheiten führen.

C2

Wie beeinflusst die Rezeptordynamik die Wirksamkeit und Verweilzeit von Liganden an Adenosinrezeptoren?

Die Rezeptor-Ligandenbindung wird derzeit nur statisch beschrieben und berücksichtigt nicht die Konformationsdynamik der Rezeptoren, sowie deren Einfluss auf die Verweilzeit und Wirksamkeit von Liganden. Im Rahmen dieses Projektes werden mit Hilfe hochaufgelöster Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Messungen dynamische Konformationsänderungen und Rezeptor-Ligandenbindung parallel beobachtet. Dieser Ansatz erlaubt die Messung von mikro- und makroskopischen Assoziations- oder Dissoziationskonstanten und die Verweilzeit von Liganden und deren Wirksamkeit parallel in lebenden Zellen zu erfassen.

C3

FRET-basierte Analyse der Aktivität von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren der Adhäsionsklasse

Sowohl Stimulusmodalität als auch Signaltransduktionsmechanismus von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) sind bislang schlecht verstanden. Vorarbeiten haben gezeigt, dass aGPCRs mechanische Signale auslesen können, möglicherweise durch Abstandsänderungen zwischen ihren extrazellulären und transmembranären Rezeptoranteilen. Dieses Projekt wird mittels FRET-Messungen solche Abstandsänderungen in aGPCRs unter Ligandenstimulation quantifizieren, und Aktivitätsänderungen künstlich verlängerter aGPCR-Varianten in einem etablierten Drosophila-Modell untersuchen. Schließlich werden die generierten FRET-Sensoren eingesetzt werden, um die Effekte humanpathologischer aGPCR-Mutationen auf intramolekulare Abstandsänderungen zu untersuchen.

C4

Kinetik metabotroper Glutamat-Rezeptoren

Die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) scheint um mehr als fünf Größenordnungen zu variieren, wobei methodische Gründe die Analysen begrenzen. Es sollen Verfahren entwickelt werden, die Aktivierungskinetik metabotroper GPCRs genau zu messen. Dazu werde Konzentrationssprünge von Agonisten, mechanisch oder durch geblitzte Photolyse induziert, sowie photosensible gebundene Agonisten verwendet. Die Rezeptor-Antwort wird über Förster-Resonanz-Energie-Transfer an Rezeptor-Konstrukten mit geeigneten Fluorophoren erfasst. Die Daten werden mit Markov-Modellen analysiert.

C5

Echtzeit-Analyse der Phosphorylierung und Dephosphorylierung des μ-Opioid-Rezeptors

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Phosphorylierung des μ-Opioid-Rezeptors (MOR) im Maushirn in vivo durch Agonist-selektive Rekrutierung verschiedener G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Kinasen (GRKs) reguliert ist. Wir schlagen nun vor, (I) neuartige FRET-Messungen der Interaktion von GRK2, GRK3, GRK5 und GRK6 mit MOR zu etablieren, (II) FRET-Messungen der Wechselwirkung von MOR mit G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Phosphatasen (GRPs), wie PP1a, PP1b und PP1g, zu entwickeln und (III) neu-generierte Phosphostellen-spezifische Nanobodies zur direkten Visualisierung der MOR-Dephosphorylierung mittels Super-Resolution-Mikroskopie einzusetzen.

C6

Schnelle intra- und intermolekulare Dynamiken G-Protein-gekoppelter Rezeptoren und ihre zeitliche Auflösung durch Fluoreszenz(kreuz)korrelations-Spektroskopie

Dieses Projekt hat sich zum Ziel gesetzt, Strukturdynamiken G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) in Folge ihrer Aktivierung zu untersuchen. Vermutlich besteht der GPCR Aktivierungsprozess aus mehreren schnellen Aktivierungsschritten (< Millisekunden), wobei die Dynamik dieser Aktivierung durch Liganden beeinflusst werden kann. Diese Hypothese werden wir testen, indem wir versuchen die schnellen Prozesse mit Hilfe der spektroskopischen Methoden FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer) und FCS (Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie) aufzulösen. Moderne FRET Sensoren werden dabei helfen, die individuellen Schritte der Aktivierung voneinander abzugrenzen und etwas über deren „kinetischen Fingerabdruck“ zu lernen.

C7

Signaltransduktion und subzelluläre Lokalisation der partikulären Guanylyl-Cyclasen A und B, Rezeptoren für natriuretische Peptide

Die kardiovaskulären Effekte von atrialem (ANP) und C-typ natriuretischem Peptid (CNP) werden durch zwei membranständige cGMP-bildende Guanylyl Cyclasen (GC) vermittelt: GC-A und GC-B. Um den Mechanismus der Liganden-induzierten cGMP Synthese durch diese Rezeptoren zu charakterisieren, möchten wir mittels FRET-FIAsH Technik ihre Liganden-abhängigen Konformationsänderungen in vivo, an transfizierten Zellen, darstellen. Weiterhin wollen wir mit hochauflösender Mikroskopie die subzelluläre Lokalisation von GC-A und GC-B in intakten und hypertrophierten Kardiomyozyten vergleichen.

Projektbereich Z

Zentrale Projekte

Neben dem administrativen Projekt gibt es zwei zusätzliche Teilprojekte, die erarbeitet wurden, um spezielle Anforderungen des Sonderforschungsbereichs für die umfangreiche computergestützte Auswertung experimenteller Daten und deren Verwaltung zu erfüllen. Diese Projekte sollen den Zugriff auf die wissenschaftlichen Daten während der Laufzeit des Sonderforschungsbereichs und danach gewährleisten.

DATENMANAGEMENT

Integratives Management und Verarbeitung von Daten

Ziel dieses Projekts ist der Entwurf, die Implementierung und der Betrieb einer zentralen Software-Plattform zur Speicherung, Management, gemeinsamen Nutzung und Verarbeitung von Daten aller am SFB/TR beteiligten Projekte. Die Plattform wird die Reproduzierbarkeit und Nachhaltigkeit von Forschungsergebnissen sicherstellen. Sie wird einen interaktiven Zugriff bieten und eine systematische Analyse von großen, heterogenen Datenmengen ermöglichen. Das Projekt wird daher nicht nur den beteiligten Wissenschaftlern ein Werkzeug zur Organisation und Analyse ihrer Daten bereitstellen, sondern auch den Austausch von Werkzeugen und den Wissensdialog fördern.

KOORDINATION

Zentrale Verwaltung und Projektkoordination

Aufgabe des Projektes Z3 ist die Koordination aller Aktivitäten des Sonderforschungsbereichs. Dies beinhaltet die administrative Organisation (zentrale Budget- und Personalverwaltung, Berichte, Gleichstellungsmaßnahmen, Öffentlichkeitsarbeit, die Einrichtung eines strukturierten Qualifizierungskonzepts für den wissenschaftlichen Nachwuchs etc.), sowie die Förderung einer effizienten Kommunikation (interne und externe Veranstaltungen, Treffen und Workshops) aller Mitglieder des SFB/TR an beiden Standorten.